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Blotting-Techniken
Blotting-Techniken beinhalten die Trennung (über Elektrophorese) und den Transfer von DNA, RNA oder Proteinen auf eine Blotting-Membran. Für den Nachweis folgt auf diese Trennung und Fixierung im Allgemeinen die Hybridisierung des Ziels mit einem markierten Molekül. Southern-Blotting wird verwendet, um auf spezifische DNA-Sequenzen auszuwerten und kann bei der Identifizierung genetischer Mutationen und in der Forensik verwendet werden. Northern Blotting konzentriert sich auf RNA-Sequenzen und ist hilfreich bei der Beurteilung von Genexpressionen. Western Blotting identifiziert Proteine und Antikörper und findet Anwendung bei der Diagnose von Infektionskrankheiten, Proteinanomalien (wie der Prionenerkrankung) und Autoimmunerkrankungen. Obwohl diese Tests eine gute Spezifität aufweisen, haben sie aufgrund ihrer Kosten, ihres Arbeitsaufwands und ihrer Dauer erhebliche Nachteile.
Redaktionelle Verantwortung: Stanley Oiseth, Lindsay Jones, Evelin Maza
Inhalt
- ÜberblickDurchführungAnwendungVor- und NachteileQuelle
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Überblick
Definition
Blotting ist ein Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von Makromolekülen wie Nukleinsäuren Nukleinsäuren Nukleinsäuren und Proteinen. Ermöglicht wird dies durch folgende Schritte:
- Trennung mittels Elektrophorese
- Übertragung auf eine Membran
- Nachweis mit einer markierten Sonde
Arten des Blotting
Die 4 Grundtypen des Blottings sind
- Southern
- Northern
- Western
- Eastern (selten im klinischen Umfeld verwendet)
Vergleich der Blotting-Techniken
| Technik | Southern Blot | Northern Blot | Western Blot |
|---|---|---|---|
| Zielstruktur | DNA-Sequenzen | RNA-Sequenzen | Proteine Proteine Proteine und Peptide |
| Trennung | Elektrophorese | Elektrophorese | Elektrophorese |
| Blotting-Methode | Kapillartransfer | Kapillartransfer | Elektrophoretischer Transfer |
| Sonde | Oligonukleotide | Oligonukleotide | Antikörper |
| Gängige Nachweismethoden |
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Elektrophorese
Alle Blotting-Techniken verwenden die Elektrophorese, bei der ein elektrisches Feld genutzt wird, um Moleküle zu trennen.
- Moleküle werden getrennt nach:
- Größe
- Elektrischer Ladung
- Häufig genutzt bei der Analyse von:
- DNA DNA Die Desoxyribonukleinsäure – Aufbau, Struktur und verschiedene Arten der DNA
- RNA RNA Die Ribonukleinsäure – Aufbau, Struktur und verschiedene Arten von RNA
- Proteinen
- Formen:
- Kataphorese: Elektrophorese von Kationen
- Anaphorese: Elektrophorese von Anionen
- Technik:
- Die Probe wird auf ein Gel aufgetragen.
- Das Gel wird in eine Pufferlösung gegeben.
- Es wird ein elektrisches Feld angelegt.
- Das elektrische Feld trennt die Moleküle.
Durchführung
Allgemeine Blotting-Technik
Blotting-Techniken folgen einem allgemeinen Verfahren:
- Das Zielmolekül in einer Probe wird isoliert.
- Die Elektrophorese trennt die Moleküle.
- Die getrennten Bestandteile werden auf einen Filter oder eine Membran übertragen (oder „geblottet“), um sie irreversibel zu fixieren (oder einen „Druck“ zu erzeugen).
- Der Filter/die Membran wird dann radioaktiv markierten Sonden ausgesetzt und inkubiert → Sonde bindet an das Zielmolekül
- Die Sonde und das Zielmolekül bilden Banden, die mit Röntgenfilm sichtbar gemacht werden können.
- Hinweis: Alternative Sonden- und Nachweismethoden können auch verwendet werden:
- Farbmetrik
- Chemolumineszenz
Southern-Blotting
- Restriktionsenzyme werden benötigt, um die DNA-Probe vor der Elektrophorese in Fragmente zu spalten
- Vor dem Blotting wird die getrennte doppelsträngige DNA DNA Die Desoxyribonukleinsäure – Aufbau, Struktur und verschiedene Arten der DNA mit alkalischer Lösung denaturiert → einzelsträngige DNA-Fragmente
- Blotting-Methode: Kapillartransfer der DNA DNA Die Desoxyribonukleinsäure – Aufbau, Struktur und verschiedene Arten der DNA vo einem Elektrophorese-Gel auf einen Filter
- Verwendet markierte Oligonukleotidsonden, die zur Ziel-DNA-Sequenz komplementär sind
- Die Inkubation ermöglicht die Hybridisierung der Sonde mit der Ziel-DNA.
Northern-Blotting
- Blotting-Methode: Kapillartransfer der RNA RNA Die Ribonukleinsäure – Aufbau, Struktur und verschiedene Arten von RNA von einem Elektrophoresegel auf einen Filter
- Verwendet markierte Oligonukleotidsonden, die zur Ziel-RNA-Sequenz komplementär sind
- Die Inkubation ermöglicht die Hybridisierung der Sonde mit der Ziel-RNA.
Western-Blotting
- Manchmal müssen Probenproteine vor dem Auftragen auf ein Elektrophoresegel denaturiert werden.
- Blotting-Methode: Proteine Proteine Proteine und Peptide werden elektrophoretisch (unter Verwendung eines elektrischen Feldes) vom Gel auf die Blotting-Membran übertragen.
- Verwendet Antikörper, die spezifisch zum Zielprotein passen und markiert oder unmarkiert sind:
- Am häufigsten: unmarkiert (primär) → es wird ein sekundärer markierter Antikörper verwendet, der an den primären Antikörper binden kann
- Seltener: markiert
- Die Inkubation ermöglicht die Bildung von Antikörper-Antigen-Komplexen.
Anwendung
Southern Blot
- Erkennt:
- Kleine und große DNA-Mutationen:
- Deletationen
- Duplikationen
- Umlagerungen
- Veränderungen der Genmethylierung
- Kleine und große DNA-Mutationen:
- Anwendungen:
- Forensik
- Identifizierung neuer krankheitsverursachender Mutationen
- Diagnose genetischer Erkrankungen
- Identifizierung malignitätsspezifischer genetischer Marker (z.B. BCR-ABL1-Genfusion bei CML)
Northern Blot
Northern Blotting kann verwendet werden, um RNA-Spiegel und Genexpression zu bestimmen.
Western Blot
Identifizierung von Antikörpern:
- Diagnose von Infektionskrankheiten, einschließlich:
- HIV HIV Retroviren: HIV
- Borreliose Borreliose Lyme-Borreliose
- Rickettsien-Infektionen
- Identifizierung von abnormalen Proteinen und Antikörpern, einschließlich:
- Prionenerkrankungen
- Muskeldystrophie (Dystrophinanalyse)
- Autoantikörper (z.B. Antikörper gegen die glomeruläre Basalmembran Basalmembran Syndrom der dünnen Basalmembran [GBM])
Vor- und Nachteile
Vorteile
- Allgemein: gute Spezifität
- Southern Blot: kann eine Vielzahl von Mutationen erkennen
- Westlicher Fleck:
- Hohe Sensibilität
- Kann mehrere Zielproteine auswerten
Nachteile
- Benötigt eine große Menge an DNA DNA Die Desoxyribonukleinsäure – Aufbau, Struktur und verschiedene Arten der DNA oder RNA RNA Die Ribonukleinsäure – Aufbau, Struktur und verschiedene Arten von RNA
- Langsamer, arbeitsintensiver Prozess
- Teuer
- Die Verwendung radioaktiver Stoffe kann potenziell gefährlich sein.
Quelle
- Kevil, C. G., Walsh, L., Laroux, F. S., Kalogeris, T., Grisham, M. B., Alexander, J. S. (1997). An improved, rapid Northern protocol. Biochem Biophys Res Comm 238:277–279.
- Steiling, K., Christenson, S. (2021). Tools for genetics and genomics: gene expression profiling. UpToDate. https://www.uptodate.com/contents/tools-for-genetics-and-genomics-gene-expression-profiling (Zugriff am 29.12.2021)
- Schrijver, I., Zehnder, J.L. (2021). Tools for genetics and genomics: Cytogenetics and molecular genetics. UpToDate. https://www.uptodate.com/contents/tools-for-genetics-and-genomics-cytogenetics-and-molecular-genetics (Zugriff am 29.12.2021)
- Gottlieb, G.S. (2019). Clinical manifestations and diagnosis of HIV-2 infection. UpToDate. https://www.uptodate.com/contents/clinical-manifestations-and-diagnosis-of-hiv-2-infection (Zugriff am 29.12.2021)
- Hu, L. (2021). Diagnosis of Lyme disease. UpToDate.https://www.uptodate.com/contents/diagnosis-of-lyme-disease (Zugriff am 29.12.2021)
- Mitschka, S., Mayr, C. (2020). Northern blot protocol.https://www.protocols.io/view/northern-blot-protocol-bqqymvxw (Zugriff am 29.12.2021)
- Gavini, K., Parameshwaran, K. (2021). Western blot. StatPearls.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK542290/ (Zugriff am 29.12.2021)
- Tomar, M. (2016). Types of blotting. Res Rev J Pharmaceutics Nanotechnol.https://www.rroij.com/open-access/types-of-blotting-.php?aid=79704
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Tahere S.
Medizinstudentin, Universität Jena
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Lecturio und die TÜV SÜD Akademie erhielten für den gemeinsam entwickelten Online-Kurs zur Vorbereitung auf den
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Comenius-Award 2019
Die Lecturio Business Flat erhielt 2019 das Comenius-EduMedia-Siegel, mit dem die Gesellschaft für Pädagogik, Information und Medien jährlich pädagogisch, inhaltlich und gestalterisch
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IELA-Award 2022
Die International E-Learning Association, eine Gesellschaft für E-Learning Professionals und Begeisterte, verlieh der Lecturio Learning Cloud die Gold-Auszeichnung in der Kategorie “Learning Delivery Platform”.
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In der Kategorie “Lehr- und Lernmanagementsysteme” erhielt die Lecturio Learning Cloud die Comenius-EduMedia-Medaille. Verliehen wird der Preis von der Gesellschaft für Pädagogik, Information und Medien für pädagogisch, inhaltlich und gestalterisch herausragende Bildungsmedien.
B2B Award 2020/2021
Die Deutsche Gesellschaft für Verbraucherstudien (DtGV) hat Lecturio zum Branchen-Champion unter den deutschen Online-Kurs-Plattformen gekürt. Beim Kundenservice belegt Lecturio den 1. Platz, bei der Kundenzufriedenheit den 2. Platz.
B2B Award 2022
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In der Rubrik Kundenservice deutscher Online-Kurs-Plattformen belegt Lecturio zum zweiten Mal in Folge den 1. Platz.
Simon Veiser
Simon Veiser beschäftigt sich seit 2010 nicht nur theoretisch mit IT Service Management und ITIL, sondern auch als leidenschaftlicher Berater und Trainer. In unterschiedlichsten Projekten definierte, implementierte und optimierte er erfolgreiche IT Service Management Systeme. Dabei unterstützte er das organisatorische Change Management als zentralen Erfolgsfaktor in IT-Projekten. Simon Veiser ist ausgebildeter Trainer (CompTIA CTT+) und absolvierte die Zertifizierungen zum ITIL v3 Expert und ITIL 4 Managing Professional.
Dr. Frank Stummer
Dr. Frank Stummer ist Gründer und CEO der Digital Forensics GmbH und seit vielen Jahren insbesondere im Bereich der forensischen Netzwerkverkehrsanalyse tätig. Er ist Mitgründer mehrerer Unternehmen im Hochtechnologiebereich, u.a. der ipoque GmbH und der Adyton Systems AG, die beide von einem Konzern akquiriert wurden, sowie der Rhebo GmbH, einem Unternehmen für IT-Sicherheit und Netzwerküberwachung im Bereich Industrie 4.0 und IoT. Zuvor arbeitete er als Unternehmensberater für internationale Großkonzerne. Frank Stummer studierte Betriebswirtschaft an der TU Bergakademie Freiberg und promovierte am Fraunhofer Institut für System- und Innovationsforschung in Karlsruhe.
Sobair Barak
Sobair Barak hat einen Masterabschluss in Wirtschaftsingenieurwesen absolviert und hat sich anschließend an der Harvard Business School weitergebildet. Heute ist er in einer Management-Position tätig und hat bereits diverse berufliche Auszeichnungen erhalten. Es ist seine persönliche Mission, in seinen Kursen besonders praxisrelevantes Wissen zu vermitteln, welches im täglichen Arbeits- und Geschäftsalltag von Nutzen ist.
Wolfgang A. Erharter
Wolfgang A. Erharter ist Managementtrainer, Organisationsberater, Musiker und Buchautor. Er begleitet seit über 15 Jahren Unternehmen, Führungskräfte und Start-ups. Daneben hält er Vorträge auf Kongressen und Vorlesungen in MBA-Programmen. 2012 ist sein Buch „Kreativität gibt es nicht“ erschienen, in dem er mit gängigen Mythen aufräumt und seine „Logik des Schaffens“ darlegt. Seine Vorträge gestaltet er musikalisch mit seiner Geige.
Holger Wöltje
Holger Wöltje ist Diplom-Ingenieur (BA) für Informationstechnik und mehrfacher Bestseller-Autor. Seit 1996 hat er über 15.800 Anwendern in Seminaren und Work-shops geholfen, die moderne Technik produktiver einzusetzen. Seit 2001 ist Holger Wöltje selbstständiger Berater und Vortragsredner. Er unterstützt die Mitarbeiter von mittelständischen Firmen und Fortune-Global-500- sowie DAX-30-Unternehmen dabei, ihren Arbeitsstil zu optimieren und zeigt Outlook-, OneNote- und SharePoint-Nutzern, wie sie ihre Termine, Aufgaben und E-Mails in den Griff bekommen, alle wichtigen Infos immer elektronisch parat haben, im Team effektiv zusammenarbeiten, mit moderner Technik produktiver arbeiten und mehr Zeit für das Wesentliche gewinnen.
Frank Eilers
Frank Eilers ist Keynote Speaker zu den Zukunftsthemen Digitale Transformation, Künstliche Intelligenz und die Zukunft der Arbeit. Er betreibt seit mehreren Jahren den Podcast „Arbeitsphilosophen“ und übersetzt komplexe Zukunftsthemen für ein breites Publikum. Als ehemaliger Stand-up Comedian bringt Eilers eine ordentliche Portion Humor und Lockerheit mit. 2017 wurde er für seine Arbeit mit dem Coaching Award ausgezeichnet.
Yasmin Kardi
Yasmin Kardi ist zertifizierter Scrum Master, Product Owner und Agile Coach und berät neben ihrer Rolle als Product Owner Teams und das höhere Management zu den Themen agile Methoden, Design Thinking, OKR, Scrum, hybrides Projektmanagement und Change Management.. Zu ihrer Kernkompetenz gehört es u.a. internationale Projekte auszusteuern, die sich vor allem auf Produkt-, Business Model Innovation und dem Aufbau von Sales-Strategien fokussieren.
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Leon Chaudhari ist ein gefragter Marketingexperte, Inhaber mehrerer Unternehmen im Kreativ- und E-Learning-Bereich und Trainer für Marketingagenturen, KMUs und Personal Brands. Er unterstützt seine Kunden vor allem in den Bereichen digitales Marketing, Unternehmensgründung, Kundenakquise, Automatisierung und Chat Bot Programmierung. Seit nun bereits sechs Jahren unterrichtet er online und gründete im Jahr 2017 die „MyTeachingHero“ Akademie.
Andreas Ellenberger
Als akkreditierter Trainer für PRINCE2® und weitere international anerkannte Methoden im Projekt- und Portfoliomanagement gibt Andreas Ellenberger seit Jahren sein Methodenwissen mit viel Bezug zur praktischen Umsetzung weiter. In seinen Präsenztrainings geht er konkret auf die Situation der Teilnehmer ein und erarbeitet gemeinsam Lösungsansätze für die eigene Praxis auf Basis der Theorie, um Nachhaltigkeit zu erreichen. Da ihm dies am Herzen liegt, steht er für Telefoncoachings und Prüfungen einzelner Unterlagen bzgl. der Anwendung gern zur Verfügung.
Zach Davis
Zach Davis ist studierter Betriebswirt und Experte für Zeitintelligenz und Zukunftsfähigkeit. Als Unternehmens-Coach hat er einen tiefen Einblick in über 80 verschiedene Branchen erhalten. Er wurde 2011 als Vortragsredner des Jahres ausgezeichnet und ist bis heute als Speaker gefragt. Außerdem ist Zach Davis Autor von acht Büchern und Gründer des Trainingsinstituts Peoplebuilding.
Wladislav Jachtchenko
Wladislaw Jachtchenko ist mehrfach ausgezeichneter Experte, TOP-Speaker in Europa und gefragter Business Coach. Er hält Vorträge, trainiert und coacht seit 2007 Politiker, Führungskräfte und Mitarbeiter namhafter Unternehmen wie Allianz, BMW, Pro7, Westwing, 3M und viele andere – sowohl offline in Präsenztrainings als auch online in seiner Argumentorik Online-Akademie mit bereits über 52.000 Teilnehmern. Er vermittelt seinen Kunden nicht nur Tools professioneller Rhetorik, sondern auch effektive Überzeugungstechniken, Methoden für erfolgreiches Verhandeln, professionelles Konfliktmanagement und Techniken für effektives Leadership.
Alexander Plath
Alexander Plath ist seit über 30 Jahren im Verkauf und Vertrieb aktiv und hat in dieser Zeit alle Stationen vom Verkäufer bis zum Direktor Vertrieb Ausland und Mediensprecher eines multinationalen Unternehmens durchlaufen. Seit mehr als 20 Jahren coacht er Führungskräfte und Verkäufer*innen und ist ein gefragter Trainer und Referent im In- und Ausland, der vor allem mit hoher Praxisnähe, Humor und Begeisterung überzeugt.
